斑馬魚(yú)基因編輯技術(shù)服務(wù)

項目介紹

百維斯生物具有多年斑馬魚(yú)基因編輯技術(shù)經(jīng)驗，提供全流程目的基因編輯服務(wù)，包括從同源基因分析到基因拯救的各個(gè)步驟。利用斑馬魚(yú)的優(yōu)勢，及公司專(zhuān)業(yè)的基因編輯技術(shù)，可快速構建斑馬魚(yú)各基因編輯模型，基因敲降及過(guò)表達項目縮短至一個(gè)月，斑馬魚(yú)敲除、tol2轉基因制備、定點(diǎn)定向模型構建可在5至6個(gè)月內實(shí)現，大大縮短基因編輯實(shí)驗周期。

斑馬魚(yú)的優(yōu)勢

?   斑馬魚(yú)體積小，幼魚(yú)體長(cháng)只有 1–3mm，可使用96孔微孔板進(jìn)行高通量全自動(dòng)化分析

?   成本低，占地空間?。?span lang="EN-US">100 平米空間可養殖 30000 只成魚(yú)）

?   藥物用量少（微克級），僅為鼠類(lèi)實(shí)驗的1/100至1/1000

?   體外發(fā)育，極易獲得用于生物醫學(xué)研究和藥物實(shí)驗的動(dòng)物樣本

?   產(chǎn)卵量大，每只雌魚(yú)每周產(chǎn)卵可達 300–500 枚，全年周而復始

?   發(fā)育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后2–5天，類(lèi)似于人體的主要器官均已工作，如心臟，腦，血液，血管，胰腺，肝臟等

?   身體透明，受精后前 7 天內部器官清晰可見(jiàn)，有節律心跳和血液循環(huán)

?   實(shí)驗周期短，大部分實(shí)驗能夠在 1–2 周內完成，而傳統體內實(shí)驗通常需要 1 個(gè)月以上

?   斑馬魚(yú)和人類(lèi)的疾病信號轉導通路高度保守，斑馬魚(yú)與人類(lèi)同源基因比例高達 87%，某些疾病相關(guān)基因與人類(lèi)基因保守性高達 99%，這意味著(zhù)在其身上做藥物實(shí)驗所得到的結果在多數情況下也適用于人體。

服務(wù)內容：

1. 基因敲降：為觀(guān)察目的基因的敲降對早期胚胎發(fā)育的影響，利用創(chuàng )新的 CRISPR/CasRx knockdown 技術(shù)，瞬時(shí)破壞基因的編碼序列，從而降低基因的表達水平來(lái)研究基因的功能，用于各個(gè)階段的基因功能研究。

2. 基因過(guò)表達：為觀(guān)察目的基因的過(guò)表達對早期胚胎發(fā)育的影響，通過(guò)構建目的基因過(guò)表達載體，體外轉錄合成相應的mRNA, 將mRNA  以不同劑量注射到早期胚胎中，即可研究目的基因過(guò)表達對胚胎發(fā)育及組織器官形成的影響。

3. 斑馬魚(yú)基因敲除：針對靶基因序列設計guide RNA, 指導Cas9 蛋白在特定基因位點(diǎn)引起DNA雙鏈斷裂，在體內修復斷裂DNA的過(guò)程中，靶點(diǎn)附近產(chǎn)生堿基隨機插入或缺失突變，最終導致目的基因功能缺失，從而達到基因敲除的目的。

4. 斑馬魚(yú)轉基因品系構建：將外源基因隨機整合到斑馬魚(yú)基因組中，在已知的啟動(dòng)子信息下可用于標記特定器官和細胞、指示特定基因的表達模式、調節特定基因的表達及功能水平等。

5. 斑馬魚(yú)定點(diǎn)突變構建服務(wù)：定點(diǎn)插入外源核酸片段，用于標記基因的精準表達模式，構建點(diǎn)突變，實(shí)現時(shí)間空間上控制基因表達等。

技術(shù)原理:

CRISPR/CasRx knockdown 技術(shù)原理

基因敲除技術(shù)原理

轉基因技術(shù)原理

服務(wù)流程

案例展示

1、體內驗證某基因對血管生成有促進(jìn)作用，采用血管熒光斑馬魚(yú)品系(VEGFR2:GFP)胚胎進(jìn)行敲降實(shí)驗，可見(jiàn)斑馬魚(yú)節間血管數量顯著(zhù)少于對照組，從而驗證該基因對血管的功能作用。

2、驗證CRISPR/CasRx 對外源報告基因EGFP的剪切效果，可見(jiàn)CRISPR/CasRx 能高效剪切外源報告基因EGFP。

3、混合系白血病1 (MLL1)基因在早期胚胎發(fā)育和造血中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。 MLL-AF9融合基因是染色體易位所致，常導致急性髓系白血病，預后差在較差。

研究者在斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)表達人MLL-AF9融合基因相應mRNA，發(fā)現其過(guò)表達導致了斑馬魚(yú)的造血功能異常。

部分結果如下：

(a) Western Blot結果表明，與對照組相比，過(guò)表達時(shí)胚胎中MLL蛋白含量顯著(zhù)增加；

(b) 定量PCR結果顯示，MLL下游基因表達量顯著(zhù)上升；

(c-e) 整體原位雜交分析MLL下游基因表達變化；

(f-h) 過(guò)表達MLL-AF9 mRNA時(shí)，髓系細胞標記基因l-plastin, mpy和lyz表達量增加。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、基因敲除的 sgRNA 如何設計？

sgRNA 的設計需要遵循以下原則：

1）不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因。

2）盡可能影響所有的轉錄本，敲除位點(diǎn)最好在編碼區的前 50%，但避免敲除 ATG 所在外顯子或 ATG 之 前的外顯子。

3）片段敲除的 sgRNA 設計在內含子上，這樣能敲除整個(gè)外顯子區，避免翻譯出殘留蛋白。

4）在設計 sgRNA 時(shí)要綜合考慮候選編輯位點(diǎn)的序列、位置、正負鏈、GC 含量、潛在的脫靶位點(diǎn)等信息。例如靶點(diǎn)的 GC%盡量不要低于 40%，靶點(diǎn)序列 GC%偏高（50%~70%）有較高的打靶效率；靶點(diǎn)內不 要有連續 4 個(gè)以上的 T 堿基，避免形成 RNA Pol III 的轉錄終止信號等。

2、斑馬魚(yú)胚胎顯微注射實(shí)驗操作方法

斑馬魚(yú)顯微注射是將實(shí)驗材料直接注射到1-4細胞期的斑馬魚(yú)胚胎中，由于在這個(gè)胚胎發(fā)育早期沒(méi)有膜分隔細胞和卵黃，注入1個(gè)細胞或卵黃的溶液將擴散到整個(gè)胚胎中。通過(guò)注射不同類(lèi)型的實(shí)驗樣品，實(shí)現基因的瞬時(shí)過(guò)表達、表達敲降、以及制備轉基因或突變斑馬魚(yú)品系等研究。

3、顯微注射的注意事項

顯微注射的操作過(guò)程中有許多細節影響實(shí)驗的成功率，主要包括以下幾方面。

1）注射樣品的質(zhì)量和和濃度。

2）注射前小心將顯微注射針定位，注射針定位到卵表面的注射角度是穿透堅硬的卵殼注射成功的關(guān)鍵。

3）破針時(shí)，將針尖一點(diǎn)點(diǎn)剪斷，不宜一次剪太多。

4）注射時(shí)注射器的壓力不宜變化太快，否則會(huì )造成注射量操作難以控制，導致胚胎內環(huán)境改變過(guò)快過(guò)大甚至脹破細胞。氮氣罐的壓力閥顯示氣體的壓力，壓力為0表明罐內無(wú)氣體，需要及時(shí)換氣。

5）注射完畢，慢慢抽出注射針，避免受精卵內物質(zhì)隨著(zhù)毛細針抽出，造成受精卵的損傷。