導讀

一種新型的基于 Trmt5 缺陷引發(fā)的具有自發(fā)性炎癥性腸病樣表型的斑馬魚(yú)模型

炎癥性腸病 (IBD) 是一種以胃腸道慢性炎癥為特征的復雜綜合征，研究者使用 CRISPR-Cas9 方法，基于 tRNA 甲基轉移酶 5 ( trmt5 ) 基因生成了能夠存活的trmt5 -/-斑馬魚(yú)作為一種新型斑馬魚(yú) IBD 模型。

通過(guò)對trmt5 -/-斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)（WT）進(jìn)行對比發(fā)現：trmt5?/?的腸上皮減少，腸皺襞結構消失，上皮扁平，細胞核定位紊亂，杯狀細胞減少（圖1a和圖1b）；腸上皮細胞中觀(guān)察到微絨毛被破壞和縮短，腸上皮細胞 (IEC) 的緊密連接和粘附連接有缺陷（圖1c）中腸中杯狀細胞數量減少（圖1d）。

吞咽活性測定以及油紅O染色測定結果發(fā)現：trmt5?/?突變體中右旋糖酐-FITC   在10 dpf (減少60%)和16 dpf (減少90%)時(shí)顯著(zhù)減少(圖 1e )。16 dpf時(shí)trmt5 -/-斑馬魚(yú)的前腸區發(fā)現了明顯的脂質(zhì)ORO染色信號，表明腸道脂質(zhì)代謝中斷(圖1f)。這些數據表明：突變表型主要為后期發(fā)育缺陷，反映了trmt5對幼魚(yú)發(fā)育后期階段維持腸道功能的重要性。

a：斑馬魚(yú)內臟在 5 dpf、10 dpf 和 16 dpf 時(shí)的代表性解剖圖；b：在不同時(shí)間點(diǎn)對應于兩種基因型幼蟲(chóng)的腸球或中腸的矢狀切片的代表性蘇木精-伊紅染色，紅色箭頭表示中腸中的杯狀細胞；c ：16 dpf 時(shí)trmt5 -/-和trmt5 +/+腸上皮細胞的 TEM 分析。trmt5 -/- IHC 表現出比野生型對照更短的微絨毛（紅色箭頭）；d：16 dpf 中腸矢狀切面的阿爾新藍染色；e：在 28.5 °C 下與 1% 葡聚糖-FITC 孵育 4 小時(shí)后斑馬魚(yú)消化器官的體內成像；f：油紅 O (ORO) 染色用于 16 dpf 的中性脂質(zhì)積累，左圖為整片 ORO 染色，右圖為冷凍切片。圖a-f 

應用 RNA 測序分析16 dpf 的trmt5 -/-斑馬魚(yú)與野生型斑馬魚(yú)，結果顯示trmt5 -/-斑馬魚(yú)：有 1211 個(gè)上調和 3679 個(gè)下調的不同表達基因（DEGs）（圖 1g)；腸道與 IBD 相關(guān)基因的失調（圖 1h）。在免疫應答和細菌、病毒感染過(guò)程中，上調的DEGs顯著(zhù)富集(圖1i）。通過(guò)中性粒細胞特異性轉基因斑馬魚(yú)品系（Tg (mpx: EGFP)），以及qRT-PCR分析巨噬細胞和自然殺傷細胞(NK)，也證明了trmt5的缺失會(huì )導致幼魚(yú)后期腸中中性粒細胞的募集(圖1j)。

應用 16s rDNA 擴增測序，結果顯示 trmt5 ?/?斑馬魚(yú)中：腸道微生物多樣性顯著(zhù)降低（圖1k）；微生物群存在顯著(zhù)差異（圖1l）；其腸道微生物組組成在類(lèi)和科水平上都發(fā)生了變化(圖1m)。STAMP分析表明：trmt5 -/-突變體在γ-變形菌門(mén)中表現出相對豐度增加，而被稱(chēng)為益生菌菌株和抑制炎癥的乳桿菌科的相對豐度降低?？傊?，這些發(fā)現表明trmt5 -/-斑馬魚(yú)表現出IBD的一些標志性特征，這更可能代表人類(lèi)克羅恩病。

圖g-m

G：差異表達基因 (DEG) 的火山圖，紅色和藍色圖分別表示上調和下調的 DEG；h ：IBD 相關(guān) DEG熱圖；i：與trmt5 +/+相比，trmt5?/?中 29 個(gè)上調免疫相關(guān)基因的圓形熱圖； j：7 dpf、10 dpf 和 16 dpf的trmt5 ?/?和trmt5 +/+ Tg (mpx: EGFP)轉基因幼蟲(chóng)的整體裝載。Tg (mpx: EGFP)是中性粒細胞特異性轉基因系。清晰分散的綠點(diǎn)（由紅色箭頭表示）代表嗜中性粒細胞，而彌散的綠色信號（由黑色星號表示）是斑馬魚(yú)腹腔的背景噪音；k：trmt5 ?/?和trmt5 +/+腸道微生物群的阿爾法多樣性比較；P：表示顯著(zhù)性 (** p ?< 0.01, *** p ?< 0.001)；l ：UniFrac主坐標分析（PCoA）分析：m：trmt5 ?/?和trmt5 +/+家族水平的腸道微生物群的宏基因組分析。

在trmt5 -/-突變體的腸上皮細胞中觀(guān)察到異常和細長(cháng)的線(xiàn)粒體形態(tài)（圖 1n），以及COX 和 SDH 的酶活性降低（圖1o）。這暗示了trmt5 ?/?腸中的 OXPHOS 缺乏。因此導致trmt5 -/-腸中 ATP 的產(chǎn)生減少和 ROS 的過(guò)量產(chǎn)生（圖 1p，1q）。此外，在trmt5?/?突變體中發(fā)現了線(xiàn)粒體未折疊蛋白反應(UPRmt)的激活，線(xiàn)粒體熱休克蛋白(Hsp60)在trmt5?/?斑馬魚(yú)中顯著(zhù)上調，該蛋白驅動(dòng)UPRmt，被認為是IBD的重要驅動(dòng)因素。這些數據表明：trmt5的缺失導致斑馬魚(yú)腸道線(xiàn)粒體功能障礙。這可能是自發(fā)發(fā)展的IBD-like表現型的原因。

圖n-r

n： 通過(guò)Tg（Xla.Eef1a：MLS-EGFP）轉基因幼蟲(chóng)比較trmt5 ^-/-和trmt5 ^+/+在16 dpf 的線(xiàn)粒體形態(tài)，Tg (Xla.Eef1a: MLS-EGFP)表達線(xiàn)粒體靶向EGFP，細胞核與 DAPI（藍色）共染色；o：16 dpf 的腸 COX/SDH 染色；p：16 dpf 時(shí)的相對總 ATP 產(chǎn)量；q： 16 dpf 時(shí)通過(guò) DCFH-DA 染色檢查 ROS 的產(chǎn)生；r：參與 UPR mt的蛋白質(zhì)的表達水平，包括 Hsp60、Afg3l2 和 Lonp1。

作者通過(guò)實(shí)驗還表明，乳桿菌GG (LGG)對trmt5^?/?幼魚(yú)有保護作用：緩解了IBD樣表型（圖1s）；顯著(zhù)降低促炎基因lect2l的表達(圖1t), 明顯改善吞咽活動(dòng) (圖1u)，以及延長(cháng)的中位生存期（圖1v）

圖s-v

s：實(shí)驗設計的示意圖，兩組斑馬魚(yú)在 16 dpf 時(shí)促炎基因的t mRNA 表達；u： FITC 標記的葡聚糖在16 dpf 處檢測到吞咽活動(dòng)；v：在trmt5 ^?/?斑馬魚(yú)中每天喂食LGG后，存活率顯著(zhù)延長(cháng)。

結論：本研究在斑馬魚(yú)中產(chǎn)生了第一個(gè) Trmt5 缺陷脊椎動(dòng)物系，該系具有自發(fā)發(fā)展的人類(lèi) IBD 病理特征。進(jìn)一步的研究表明，通過(guò)類(lèi)似于 IBD 治療策略能夠使該系表型得到部分緩解。因此建議trmt5 ^-/-斑馬魚(yú)可作為研究 IBD 發(fā)病機制的疾病模型，以及開(kāi)發(fā)和評估潛在治療干預措施的平臺。

點(diǎn)評：炎癥性腸病在斑馬魚(yú)上具有傳統的研究歷史，除了基因缺陷能夠引起的相關(guān)疾病以外，常見(jiàn)的TNBS等一類(lèi)藥物也能在斑馬魚(yú)上誘導相應的模型。斑馬魚(yú)豐富的免疫細胞標記品系，以及炎癥誘導效應品系（Tg(nfκb:EGFP)）能夠為炎癥性腸病的發(fā)病機理研究提供強有力的支持。

文章作者：浙江大學(xué)醫學(xué)院博士后趙瓊和博士研究生?；蹫楣餐谝蛔髡?，陳燁教授為論文通訊作者，中國醫學(xué)科學(xué)院趙春華教授和浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院邵建忠教授為共同通訊作者。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41392-023-01318-6

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