通過(guò)同源重組（HR）進(jìn)行雙鏈斷裂（DSB）的修復對于維持細胞基因組的穩定性至關(guān)重要。HR途徑的突變增加了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的風(fēng)險。PARP抑制劑（PARPi）是專(zhuān)門(mén)針對缺乏HR的腫瘤的化合物。 新型PARPi一直在開(kāi)發(fā)中，但研究仍集中在體外數據上。需要一種能夠：1）提供體內數據，2）在新型PARPi開(kāi)發(fā)過(guò)程的早期3）提供快速結果，4）成本低廉的檢測方法。在這里，提出了一種結合體內斑馬魚(yú)實(shí)驗來(lái)準確量化PARP抑制劑療效的方法。發(fā)現PARPi在斑馬魚(yú)中表現出功能性作用，通常與它們的PARP捕獲能力相關(guān)。此外展示了Olaparib介導的放射增敏在斑馬魚(yú)模型中如何保守。該方法可為新型PARPi的開(kāi)發(fā)提供早期的體內數據。此外，使用斑馬魚(yú)可以進(jìn)行聯(lián)合療法的高通量試驗，以尋找新的治療策略。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú)  PARP抑制劑  同源重組  輻照

簡(jiǎn)介：細胞中的DNA不斷受到內源性或外源性來(lái)源的破壞。尤其是DNA雙鏈斷裂（DSBs）是有毒的，因為不能修復這種損傷會(huì )導致染色體斷裂、重排、缺失、細胞死亡甚至癌癥。要修復DSBs，有兩種主要途徑，經(jīng)典的非同源末端連接（c-NHEJ）和同源重組（HR）。c-NHEJ用最少的末端處理重新連接斷裂的DNA末端，這可能導致小的插入或缺失。相比之下，HR需要對斷裂進(jìn)行廣泛的末端切除，并使用未損壞的姐妹染色單體作為模板進(jìn)行無(wú)誤修復。維持這些通路的完整性對于維持體內平衡至關(guān)重要。HR通路的關(guān)鍵基因是BRCA1和BRCA2。種系BRCA1 / 2突變的雜合子攜帶者顯著(zhù)提高了乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌和胰腺癌的風(fēng)險。這些癌癥是由體細胞中第二等位基因失活引起的，導致HR缺陷，基因組不穩定，最終導致腫瘤發(fā)生。

聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是一組參與DNA損傷修復的蛋白質(zhì)。已經(jīng)描述了幾種PARP蛋白，其中PARP1在單鏈斷裂（SSB）修復中特別重要。單鏈斷裂后，PARP1以稱(chēng)為“ PARylation”的過(guò)程結合DNA并合成Poly ADP-核糖鏈。 該過(guò)程募集了與SSB修復有關(guān)的其他蛋白質(zhì)，在這些蛋白質(zhì)的作用下，修復了損傷并維持了細胞活力。PARP抑制劑（PARPi）是一類(lèi)通過(guò)抑制PARP的催化活性或將PARP捕獲到受損DNA上而起作用的一類(lèi)化合物。結果，防止了SSB的修復。 在復制單元中，這些未修復的SSB導致復制叉崩潰，并轉換為單端DSBs。由于這些斷裂的結構，它們不適合通過(guò)c-NHEJ進(jìn)行修復。相反，用HR來(lái)修復單端DSB并重新啟動(dòng)復制叉。在缺乏功能性HR的細胞中（與BRCA1 / 2相關(guān)的腫瘤就是這種情況），這些未重新啟動(dòng)的復制叉無(wú)法分解，DSB積聚，細胞毒性隨之產(chǎn)生。因此，抑制PARP會(huì )導致HR缺陷細胞的細胞死亡，而具有HR能力的細胞則可以適當修復損傷。通過(guò)消耗兩條途徑（在這種情況下為SSB修復和HR）有選擇地殺死細胞的原理稱(chēng)為“合成殺傷力”。 目前正在臨床應用一些PARPi，來(lái)治療伴有HR相關(guān)缺陷的多種癌癥。新型PARPi正在不斷開(kāi)發(fā)中，目的是發(fā)現具有更高PARP-1選擇性且副作用更少的更有效的藥物。建立PARPi功效的大多數臨床前工作都依賴(lài)于體外測定，僅在后期驗證中使用小鼠異種移植進(jìn)行體內驗證。雖然小鼠異種移植模型對于建立PARPi的療效至關(guān)重要，但是它們昂貴，耗時(shí)，因此只能在PARPi驗證過(guò)程的后期使用。因此需要一種能夠：1）提供體內數據，2）在PARPi開(kāi)發(fā)過(guò)程中的早期，3）提供快速結果和4）成本低廉的檢測方法。

斑馬魚(yú)由于其低飼養成本、初始光學(xué)透明性和易于進(jìn)行基因改造而越來(lái)越多地用于癌癥研究。斑馬魚(yú)目前正在成為研究DNA損傷和修復的重要模型生物。人類(lèi)和斑馬魚(yú)之間有幾個(gè)途徑是非常保守的，如核苷酸切除修復、堿基切除修復、c-NHEJ和HR。我們的小組以前研究發(fā)現，斑馬魚(yú)的HR途徑可以通過(guò)Rad51 foci的免疫熒光染色來(lái)可視化和量化，Rad51 foci在HR修復過(guò)程中與Brca2形成復合物。在本文中，我們證明了brca2-/-突變斑馬魚(yú)對PARPi處理的敏感性。 這種敏感性可用作新PARPi的初始篩選工具。此外，我們描述了Rad51foci測定法如何準確定量斑馬魚(yú)中PARPi的功效。通過(guò)測量由應用PARPi引起的復制叉重新啟動(dòng)期間形成的Rad51 foci的數量，可以量化該功效。 Rad51 foci的形成與PARPi暴露和活性明確相關(guān)。最后，我們演示了斑馬魚(yú)如何與其他療法結合用于測試PARPi的功效。

結果：眼睛大小測試揭示PARPi對brca2-/-突變體的毒性：缺乏HR的癌細胞長(cháng)期暴露于PARPi會(huì )導致DNA損傷積累和細胞死亡。為評估HR缺乏斑馬魚(yú)的這種毒性，將brca2+/-魚(yú)雜交，并在受精后6小時(shí)（hpf）將后代暴露于不同濃度的Olaparib。在72hpf時(shí)，用5μM或10μM Olaparib處理過(guò)的brca2 + / +和brca2 +/-幼蟲(chóng)看起來(lái)正常，而brca2-/-突變體顯示出嚴重的發(fā)育畸形（小眼睛，彎曲的尾巴，后腦浮腫，圖1A）。作為定量標記，我們對幼蟲(chóng)進(jìn)行了橫向定位，并測量了它們的眼睛大小。未經(jīng)處理的brca2-/-突變體的眼睛大小與野生型沒(méi)有統計學(xué)差異。然而，在用5和10μM Olaparib處理后，brca2-/-突變體的眼睛明顯小于野生型，表明其具有合成致死毒性。在更高濃度（20μM）下，我們觀(guān)察到所有組的嚴重毒性。我們還對Talazoparib，Niraparib和Veliparib進(jìn)行了這個(gè)實(shí)驗。觀(guān)察到Talazoparib的眼睛大小從0.5μM開(kāi)始減小。而Niraparib的眼睛大小從則從5μM開(kāi)始減?。▓D1D）。對于Veliparib，我們只能在非常高的劑量下觀(guān)察到眼睛大小的微小變化。

圖1、brca2-/-突變體幼蟲(chóng)對Olaparib治療敏感。A） 在6hpf下，將brca2+/-胚胎的雜交體暴露在5μM的Olaparib中，在52hpf時(shí)更換Olaparib。在72hpf時(shí)，對brca2+/+和brca2-/-幼蟲(chóng)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)比較。brca2-/-幼蟲(chóng)眼睛較小，尾巴彎曲，后腦水腫（黑色箭頭）。B-E）暴露于不同劑量的Olaparib（B），Talazoparib（C），Niraparib（D）和Veliparib（E）的brca2胚胎中眼睛的相對大小。在72hpf時(shí)，對基因型之間的眼睛大小進(jìn)行量化（眼睛大小測試）。數據標準化為未經(jīng)處理的brca2+/+幼蟲(chóng)。每種情況至少包括3只幼蟲(chóng)。

吖啶橙檢測顯示PARPi處理的斑馬魚(yú)brca2-/-突變株的細胞死亡增加：為了直接觀(guān)察PARPi對胚胎細胞死亡的影響，我們進(jìn)行了吖啶橙試驗。簡(jiǎn)而言之，將brca2 +/-魚(yú)雜交，將6hpf的胚胎暴露于幾種濃度的Olaparib中。在24hpf條件下，用吖啶橙法觀(guān)察細胞死亡情況。二甲基亞砜處理的brca2-/-胚胎沒(méi)有表現出比野生型更多的凋亡細胞。然而，與野生型相比，用1μM Olaparib處理可導致brca2-/-胚胎中的凋亡細胞增加約3倍。在2μM處，細胞死亡甚至更高，突變體的凋亡細胞數是對照組的7.5倍。在較大劑量下，brca2 + / +和brca2 +/-胚胎的細胞死亡水平也升高。我們還對Talazoparib，Niraparib和Veliparib進(jìn)行了吖啶橙分析。 對于Talazoparib，brca2-/-特異性細胞死亡發(fā)生在0.5μM，但是在0.75μM時(shí)，brca2 + / +和brca2 +/-胚胎也都發(fā)生了損傷。

圖2、用Olaparib（A），Talazoparib（B），Niraparib（C）和Veliparib（D）處理的brca2cmg35胚胎的吖啶橙分析。 在每種情況下至少包含3個(gè)胚胎。 這表明Talazoparib在合成致死性和一般毒性之間的劑量范圍非常狹窄。 Niraparib在5μM在5μM處表現出最佳的合成致死效應。盡管使用了非常高的濃度，Veliparib并未顯示出任何增加的brca2-/-特異性細胞死亡?？傊?，斑馬魚(yú)的brca2-/-突變體在PARPi暴露后會(huì )發(fā)生細胞死亡。

Rad51foci檢測證明Olaparib誘導DSB后HR途徑上調:以前的研究表明brca2-/-突變體對PARPi治療敏感。接下來(lái)，想評估PARPi誘導的細胞死亡是否是由正在進(jìn)行細胞分裂的斑馬魚(yú)細胞中DSBs的上調引起的。為此，我們將72hpf Tg（EF1a：mCherry-zGem）oki011胚胎暴露于不同濃度的Olaparib中7小時(shí)，然后進(jìn)行γH2AX foci測定。該分析可以顯示在細胞周期晚期S/G2期復制叉重啟期間形成的DSBs。我們專(zhuān)注于72hpf幼蟲(chóng)的大腸細胞，因為這個(gè)組織在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)增殖性很強。盡管用DMSO處理的胚胎僅表現出少量的γH2AX foci，但在用Olaparib處理的幼蟲(chóng)中其明顯上調。主要在Geminin陽(yáng)性細胞中觀(guān)察到γH2AX foci。 得出的結論是，Olapaparib在分裂細胞中誘導DSB。接下來(lái)，我們調查了是否可以通過(guò)HR途徑修復Olaparib誘導的DSB。Tg（EF1a:mCherry-zGem）oki011胚胎具有很高的HR，因此可以使用Rad51 foci分析來(lái)量化HR的數量。雖然用DMSO處理的幼蟲(chóng)細胞未顯示Rad51 foci（圖3A），但暴露于Olaparib的幼蟲(chóng)在Geminin陽(yáng)性細胞中顯示出Rad51 foci數量增加。對不同濃度的分析顯示出明顯的劑量依賴(lài)性反應，使用400μM Olaparib可發(fā)現最大數量的Rad51 foci。隨后調查了HR缺陷型brca2-/-幼蟲(chóng)在PARPi治療中Rad51 foci的水平。不出所料，雖然brca2 + / +和brca2 +/-胚胎均顯示Rad51 foci的上調水平，但brca2-/-突變體幾乎未顯示Rad51 foci，表明這些魚(yú)中的DSB不能正確修復?？傊?，暴露于Olaparib會(huì )導致DSB的產(chǎn)生，隨后通過(guò)HR對其進(jìn)行修復。

圖3. PARPi處理可誘導HR途徑良好的幼蟲(chóng)產(chǎn)生Rad51 foci。藍色：DAPI，紅色：Geminin，綠色：Rad51。 （B）暴露于400μMOlaparib的幼蟲(chóng)切片。（C）Olaparib的劑量反應曲線(xiàn)。 每個(gè)條件至少包括3個(gè)幼蟲(chóng)。（D）將雜交的brca2 +/- 72hpf幼蟲(chóng)暴露于400μM中7小時(shí)，然后進(jìn)行Rad51 foci測定。 將處理過(guò)的brca2 + / +幼蟲(chóng)的數據標準化。每個(gè)條件至少包括3個(gè)幼蟲(chóng)。（E） 72hpf-Tg（EF1a:mCherry-zGem）oki011幼蟲(chóng)用于比較Olaparib、Talazoparib、Niraparib和Veliparib在400μM暴露（300μM Talazoparib）和5μM暴露。每種條件至少包括4只幼蟲(chóng)。

Rad51foci分析揭示了PARPi在通過(guò)HR誘導修復中的差異：由于PARPi抑制或捕獲PARP的能力不同，因此我們假設可以通過(guò)評估發(fā)生的HR修復量在斑馬魚(yú)中捕獲這些差異。在斑馬魚(yú)中評估了相同的四種臨床可用的PARPi（Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib）及其誘導Rad51 foci的能力。為此，將72hpf Tg（EF1a：mCherry-zGem）oki011幼蟲(chóng)暴露于400μM的每種PARPi中，因為該劑量顯示了olaparib的最大作用（由于溶解度問(wèn)題，對于Talazoparib僅使用300μM）。隨后，魚(yú)在暴露7小時(shí)后被固定。與二甲基亞砜對照組相比，Olaparib, Niraparib, Veliparib, 和Talazoparib處理的Rad51foci增加了15倍。相比之下，Veliparib只誘導了4倍多的Rad51foci。這很可能反映了它作為PARP的較弱捕捉者的地位。Talazoparib被認為是最有效的PARPi之一。為了確認這種效力在我們的體內斑馬魚(yú)模型中是保守的，我們將Olaparib，Talazoparib和Niraparib的劑量降至5μM，并評估了Rad51 foci的數量。在這個(gè)劑量下，Olaparib, Niraparib僅顯示Rad51 foci的適度增加。 相反，Talazoparib仍顯示出明顯更多的foci?？傊?，斑馬魚(yú)的Rad51病灶分析可以用來(lái)研究PARPi的療效。

斑馬魚(yú)是評價(jià)PARPi聯(lián)合放射效果的理想模式生物：除了PARPi單一療法外，將PARPi與其他治療相結合的最終目標是增加對腫瘤組織的細胞毒性。在這項研究中，我們調查了Olaparib的放射增敏作用。為此，收集了雜交的brca2 +/-胚胎，并在6hpf時(shí)與400μM Olaparib脈沖，5 Gy IR，Olapaparib和IR的組合或DMSO對照孵育。 在24hpf時(shí)觀(guān)察胚胎，應用吖啶橙法。所有接受Olaparib脈沖的胚胎看起來(lái)都很正常，但是吖啶橙分析確實(shí)顯示brca2-/-胚胎的凋亡細胞比野生型增加了2.5倍。所有接受5?Gy照射（IR）的胚胎顯示大腦輕微的不透明。吖啶橙分析顯示，與未放射對照組相比，凋亡細胞顯著(zhù)增加，與brca2基因型無(wú)關(guān)。另一方面，Olaparib脈沖和IR聯(lián)合應用可導致嚴重的形態(tài)學(xué)畸形。在這種情況下，由于損傷太嚴重而不能應用吖啶橙法。數據表明，Olaparib對斑馬魚(yú)的放射增敏作用不依賴(lài)于brca2等位基因的存在。綜上所述，我們的研究表明，斑馬魚(yú)可以用來(lái)測試PARPi與放射聯(lián)合的療效。

圖4、Olaparib可使斑馬魚(yú)放射增敏。（A） 將brca2+/-6hpf雜交胚胎暴露于400μM Olabarib中30?分鐘。在24小時(shí)時(shí)，應用吖啶橙測定法。每個(gè)條件至少包括6個(gè)胚胎。（B）用5 -Gy放射雜交的brca2 +/- 6hpf胚胎。 在24hpf下進(jìn)行吖啶橙測定。 每個(gè)條件至少包括5個(gè)胚胎。（C）Olaparib脈沖，放射、Olaparib和放射組合后的24hpf胚胎的圖像。Olaparib脈沖不引起視覺(jué)形態(tài)畸形。 5 Gy IR單一療法會(huì )導致大腦輕微不透明（藍色箭頭）。Olaparib結合IR會(huì )導致嚴重的形態(tài)畸形，例如眼球縮小，大腦變小和尾巴彎曲（黑色箭頭）。

結論：我們開(kāi)發(fā)了一種體內工具來(lái)準確預測PARP抑制劑在斑馬魚(yú)體內的有效性。禁用HR后，斑馬魚(yú)對PARPi表現出細胞毒性。如Rad51 foci形成所示，在PARPi存在下，HR途徑上調。 諸如PARPi放射增敏的組合療法可在斑馬魚(yú)中復制。我們的實(shí)驗結果可能有助于新型PARPi的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，提供早期的體內數據。此外，斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的使用為聯(lián)合療法的快速和高通量測試為尋求新穎的治療策略打開(kāi)了大門(mén)。

原文出自：Zebrafish as an in vivo screening tool to establish PARP inhibitor efficacy - ScienceDirect